一、实验原理

细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。

二、实验步骤

1. 取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。

2. 用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。

3. 按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。

4. 按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10~14天。

5. 把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。

软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。

三、注意事项

1. 在进行软琼脂克隆形成实验时，首先细胞计数要准确，可以重复计数，取平均值。其次在实验的操作过程中，很多步骤可能会引起污染，这个问题一定要注意。

2. 在将细胞悬液和琼脂混合的时候，一定要把握好琼脂的温度，太高时，容易引起部分细胞死亡，太低则容易使局部结块。

3. 关于选择接种多少细胞的问题，24孔板一个孔，30~50个细胞已足够。太少，结果不准确；太多，计数太麻烦。当然，这还要根据细胞增殖能力或者说恶性程度来决定。当细胞增殖能力非常强时，可选择少接种一些细胞；当细胞增殖能力很弱时，可增加细胞接种数。

 

克隆形成示例图