luciferase
双荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是研究基因之间调控机制的方法之一，其阐述的是DNA-DNA,RNA-DNA的调控关系。常见的研究有转录因子TF与靶基因的调控、miRNA与靶基因的调控，miRNA与lncRNA/circRNA的调控。
这里以miRNA与靶基因的调控研究为例，描述luciferase的研究过程。
一、生物信息学分析
通过生物信息学分析预测miRNA与靶基因3'UTR区域的结合位点。根据结合位点序列设计突变位点序列。
二、载体构建
分别构建以下过表达质粒：
1. miRNA过表达质粒、miRNA-NC
2. 靶基因3'UTR野生型质粒WT（LUC载体）
3. 靶基因3'UTR突变型质粒MUT（LUC载体）
三、Luciferase检测
1. 细胞培养：
以RPMI1640培养基扩增培养293T细胞，至指数生长期，1200rpm离心4min.
2. 细胞铺板：
以血球计数板计数收集的293T细胞，调整细胞密度为105/ML,然后接种至24孔板，每孔的细胞数量4×104.
3. 细胞转染：
根据lipo3000的操作说明进行共转，共转染分组如下：
A:miRNA + 靶基因3'UTR-WT
B:miRNA + 靶基因3'UTR-MUT
C:miRNA-NC + 靶基因3'UTR-WT
D:miRNA-NC + 靶基因3'UTR-MUT
每组同时转染海肾荧光素酶质粒pRL-TK作为内参。
4. 双荧光素酶活性检测：
4.1 细胞裂解：
细胞转染48h后，弃上清，并以PBS轻轻洗涤一次细胞，然后每孔加入200ul细胞裂解液，冰育5-10min,充分裂解细胞；
4.2 工作液配制：
按照双荧光素酶检测试剂盒说明书，分别以对应的缓冲液稀释萤火虫荧光素酶底物、海肾荧光素酶底物至1×，冰上静置；
4.3 荧光检测：
取4.1中裂解液20ul,加入96孔酶标板中，加入100ul萤火虫荧光素酶反应液，放入酶标仪，设置震板混匀，检测萤火虫荧光素酶活性；
检测完萤火虫荧光素酶活性后，每孔加入100ul海肾荧光素酶反应液，放入酶标仪，设置震板混匀，检测海肾荧光素酶活性。
5. 数据分析、作图。
