RNA pull down
RNA pull down 实验
RNA pull-down 是检测 RNA 结合蛋白与其靶 RNA 之间相互作用的主要实验手段之一。RNA pull-
down 使用体外合成或者体外转录法标记生物素 RNA 探针，然后与细胞裂解后的蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过 Western Blot 实验检测特定的 RNA 结合蛋白是否与 RNA 相互作用。因此，RNA pull down 常被用来研究 LncRNA 相互作用的蛋白。
实验步骤
1.准备细胞裂解物
a.收取目的细胞（~107），1000 rpm，4℃离心 5min 收获细胞，弃去上清。
b.使用加入 1ml 冰冷的 PBS 重悬细胞，1000 rpm，4℃离心 5min。
c.加入 500 ul Cell lysis buffer （+新鲜的蛋白酶抑制剂，RNAse 抑制剂，DTT）重悬沉淀，置于冰上 5min，期间颠倒混匀几次。
d.13000g，4℃离心 10min。
e.收集上清直接用于实验或储存于-80 ℃。
2.制备生物素标记的 RNA
（1）制备 DNA 模板
（2）体外转录实验
（3）标记 RNA 探针
3.RNA 进行 Pull down 实验
a.取 150 µl Pierce Nucleic-Acid Compatible Streptavidin Magnetic Beads，使用 Wash Buffer 洗涤 beads 两 次，去除 stock solution，最后使用 RNA Capture Buffer 重悬 Beads。
b.在 Beads 中加入已经标记好的 Biotin-RNA，孵育 15-30 分钟。
c.使用 Wash Buffer 洗涤 beads 两次，使用 1xProtein-RNA Binding Buffer 重悬 Beads。
d.进行 Pull-down 实验。体系如下：
| 10X Protein-RNA Binding Buffer | 10 µL |
| 50% glycerol | 30 µL |
| Additional salts, etc. | 10 µL |
| Lysate (protein conc. > 2mg/mL) | 30 µg |
| Nuclease-free water to 100µL | |
e.在 rotary shaker 中 4 ℃翻转孵育 1 h。
g.使用 50 µL Biotin Elution buffer 洗脱蛋白，进行下游分析。
4.蛋白鉴定：对Pull down产物进行WB实验或者做蛋白质谱鉴定
实验结果
银染图
质谱鉴定
WB检测
此外，RNA pull down技术也应用在RNA-RNA之间的互作研究中，例如miRNA与lncRNA的结合，这时pull down的产物的RNA，对产物的鉴定需要做PCR，结果如下图：
