细胞凋亡-励茨（上海）生物科技有限公司

细胞凋亡

一、实验原理

细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine， PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

二、实验步骤

1. 取1块24孔板，接种指数生长期目的细胞：100000个/孔，设置NC对照组及实验组，3复孔/组；
2. 细胞接种24h后，更换新鲜RPMI1640培养基500ul（含2%FBS）；
3. 取lipofilter约2.4ul，以RPMI1640培养基（含2%FBS）47.6ul混匀，室温静置5min；
4. 取制备的siRNA约50pmol（2ul），以RPMI1640培养基（含2%FBS）46ul混匀；
5. 将步骤3与4准备的2管溶液混合，轻轻混匀，室温静置20min后加入步骤b的细胞中；
6. 培养6h后，更换新鲜RPMI1640培养基（含10%FBS）500ul，继续培养；
7. 培养72h后，300g，4℃，离心5min；
8. 以预冷PBS重悬细胞，并300g，4℃，离心5min；
9. 弃PBS，加入100ul的1*Binding buffer重悬细胞；
10. 加入5ul的Annexin V-FITC和10ulPI Staining Solution，轻轻混匀；
11. 避光，室温反应10-15min；
12. 加入400ul 1*Binding Buffer，混匀后放置于冰上，在1h以内流式检测。

三、注意事项

1. 整个操作过程动作要尽量轻柔，切勿用力吹打细胞，尽量在4 ℃下操作。
2. 反应完毕后要尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应一小时后荧光强度就开始衰变。
3. Annexin V-FITC是光敏物质，在操作时要注意避光。

FITC/PI双染法检测细胞凋亡示例图