实时荧光定量PCR
荧光定量 PCR（Realtime fluorescence quantitative PCR,qPCR）也称作实时荧光定量 PCR.它是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时检测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对初始模板进行定量分析的方法。该技术于 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出，它的出现解决了传统 PCR 不能对初始模板定量分析的问题。荧光定量 PCR 具有准确性高、灵敏度高、特异性强等优点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。
荧光定量 PCR 原理
在 PCR 反应体系中加入荧光基团，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化检测产物量的变化，最终得到得到一条荧光扩增曲线图，扩增曲线横坐标表示循环数，纵坐标表示荧光强度。
图 1:qPCR 扩增曲线图
一般而言，荧光扩增曲线可以分为三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期）、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化；在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数；只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。
染料法荧光定量 PCR 是利用荧光染料与双链 DNA 小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加。其中以SYBR GreenⅠ最常见。
图 2:荧光染料法原理
SYBR GreenⅠ是一种荧光染料，可与双链 DNA 非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green Ⅰ发出微弱的荧光，但一旦与双链 DNA 结合，其荧光增加 1000 倍。一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链 DNA 量呈比例，且会随扩增产物的增加而增加，可通过荧光信号的增加来记录产物的增加。
PCR数据统计图示例
