Western Blot
蛋白免疫印迹（Western Blot）在医学科研中应用非常广泛，是非常基础的分子生物学技术。Western blot是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
实验步骤
一、蛋白提取
1. 融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM.
2.去除细胞培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍（如果血清中的蛋白不干扰后续实验，可以不洗）。以六孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用移液器反复吹打，使细胞和裂解液充分接触。
3.将细胞裂解液转移至1.5mL的离心管中，置于冰上放置30min,每隔10min vortex一次，使细胞裂解充分；4℃10000-14000g离心10min,取上清，即可进行后续的蛋白电泳操作。
二、BCA法测样本中蛋白含量
取A液和B液以50:1的比例混匀，96孔板每孔加入200μl,
另用标准品做一标准曲线，浓度梯度如下：
2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625μg/ml;
每孔加入标准品或样品20μl,37 ℃孵育30 min,酶标仪检测样品在562 nm波长下的吸光值并计算出相应蛋白浓度（μg/μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg /μL），根据样品浓度确定上样量。
三、蛋白印记法测蛋白含量
1. 将蛋白液与5X loading buffer一起混匀后，放入100℃金属浴5-6min.放置冰上，待上样。
2. 准备配制SDS-PAGE分离胶。
选择10%的分离胶按顺序加各溶液，混匀好，加入两块制胶玻璃板中，用水封平。待下层胶凝固后，将水倒掉，吸干，开始配制浓缩胶。
按顺序加各溶液，混匀好，加入两块制胶玻璃板中，不要有气泡，立即将梳子插入，凝固后将梳子拔出。
做好制胶槽后，放在冰上，将电泳buffer倒入后，开始上样，每个孔上样40μg.记录上样次序。
事先配制Running buffer【tris 3.028g（25mM），Gly 14.413g（192mM），10% SDS 10mL（0.1% SDS），用ddH2O定容至1000mL】，需放在4℃预冷。
Transfer buffer 【tris 3.028g （25mM），Gly 14.413g（192mM），甲醇（Methanol） 100mL用ddH2O定容至1000mL】，需放在4℃预冷。
4. 上层胶60v,30min;下层胶100v,90min.电泳结束后需要将胶放在PBS润洗2min,再放入转膜缓冲液中浸泡平衡。
5. 将剪好的PVDF膜先在甲醇中浸泡5min,后在ddH2O中浸泡2min,最后在transfer buffer 中浸泡平衡15min.
6. 垫子、膜和胶的放置：红、（+）白架子、垫子、滤纸、膜、胶、滤纸、垫子、黑架子、黑（-）。转膜条带是从-到+.
7. 冰上转移，200mA恒流转膜，根据蛋白分子量大小确定转膜时间。转移结束后将膜放入PBS中浸泡3-5min,剪膜。
8. 用5%脱脂牛奶（0.75g奶粉+15mL PBS）在37℃封闭1-2h.
9. 洗膜，1×PBS-T（1000mL 1×PBS+1mL Tween-20） 5-10 min,三次。
10. 孵育一抗（Hexokinase 1,1:1000稀释；NOS3,1:200稀释；ACSS2,1:1000稀释；NSE/ENO2,1:1000稀释；β-actin,43kDa,1:1000稀释），以上抗体均用5%脱脂牛奶稀释，4℃ 孵育过夜。
11. 从冰箱中取出膜，洗膜，1×PBST 5 min/次，6次。
12. 加二抗（鼠抗，1:5000;兔抗，1:10000），37℃，2h,摇床。
13. 洗膜，1×PBST 5 min/次，6次。
14. 化学发光显影 （Millipore ECL system）。
15. 结果分析（Tanon, TanonImage） 记录、拍照、扫描和保存。
结果示例
Western blot
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