慢病毒

慢病毒(Lentivirus)载体是以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础发展起来的基因治疗载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的 Lentivirus 为“自杀”性病毒,即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞,也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。Lentivirus 中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险,吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒,除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性,否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。
三质粒系统
将HIV-1基因组中负责包装,逆转录和整合所需要的顺式作用序列结构和编码反式作用蛋白的序列分离,再克隆到三个独立的质粒中,并去除了所有的辅助序列。极大地增加了病毒的安全性,是目前比较常用的慢病毒包装系统。三质粒的结构如图3所示。
◆ 包装质粒(Packaging plasmid):含有CMV启动子,控制gag,pol,tat,rev基因的表达,编码部分结构蛋白和调节蛋白。
◆ 包膜质粒(Envelope plasmid):含有表达水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)基因的序列,这个基因用于代替原病毒的env基因,这个基因的产物,可以提高病毒的宿主范围。
◆ 载体质粒(Transfer plasmid):其中含有病毒LTR以及研究人员所感兴趣的基因序列结构。不过需要注意的是,载体质粒的表达依赖包装质粒中tat基因的启动。
慢病毒有其独特的优点:
◆ 有更广泛的宿主,对于分裂和非分裂细胞均具有感染能力。对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率,使目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加。
◆ 稳定表达。慢病毒可以将外源基因有效的整合到细胞染色体中,且目的基因对转录沉默作用有一定的抵抗能力,可以在靶细胞中得到持续高效稳定的表达。
◆ 经过构建后的慢病毒载体可以携带大约5kb,甚至更长的目的基因。因此除了外源的short-hairpin RNAs(shRNAs)等小分子外,很多cDNA也能被克隆进入慢病毒载体,当然随着目的基因长度的增加,其病毒滴度也会随之下降。
基于慢病毒的优点,可以利用慢病毒载体系统进行转染目的基因或RNAi基因的常规实验操作,同时慢病毒在基因编辑、基因治疗、转基因动物、药物研究等领域也发挥着重要作用。