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CHIP及ChIP-seq实验服务

染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）是用于研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。通过对ChIP富集得到的DNA片段进行大规模测序（ChiP-seq），可获得数百万条序列标签，并能把所关注的蛋白的DNA结合位点精确定位到基因组上。ChiP-seq具有背景低、信噪比高、定位精度高、高灵敏度等优势。

一、CHIP实验流程

1. 交联固定：配置1% PBS甲醛，然后将10ml的1%甲醛加入到样本中；室温摇床慢摇10min,用500 ul 2.5M 甘氨酸中止固定，继续慢摇5 min;然后300g,5min离心。

2. 取细胞核：弃培养液，用大量冰预冷的PBS洗3遍，每一遍洗完后300g,5min离心，最后弃上清保留固定过的样本，用1ml IP dilution buffer重悬；

3. 染色质片段化：样品转到2ml EP管，冰上超声：20次，30s on/30s off;13200rpm,10min ,4度，收集上清，留取50ul用作In put备用；

4. 孵育：将上清分成两份，一份加入IgG抗体，一份加入目的蛋白抗体，然后4度孵育过夜；在孵育好的抗体-超声裂解物中加入 Protein G beads,然后4度孵育4小时；

5. 洗脱：使用Wash buffer wash Beads 4次后，使用Elution buffer进行洗脱；在洗脱产物中加入蛋白酶K,65度消化过夜；

6. 纯化：用QIAquick PCR Purification Kit 纯化样品；

7. CHIP-qPCR检测：设计引物，通过qPCR进行目标基因的定量检测。

CHIP-qPCR示例图

二、CHIP-seq实验和数据分析

（一）CHIP-seq实验过程

CHIP实验获得的DNA样品进行建库，上机测序。

本研究使用 Diagenode 公司 MicroPlex Library Preparation Kit v2 为例，进行ChIP-seq 建库，具体操作步骤如下：

1. 样本质检：在建库之前需要对样本进行质量控制检测。使用 Life 公司 Qbit 定量试剂盒对 ChIP 得到的 DNA 样本进行定量。然后使用安捷伦公司 2100DNA 电泳仪对微量的 DNA 进行片段大小确认。（要求 DNA 含量>0.5 ng/μL,片段分布在 100-600 bp 之间）

2. 末端修复、磷酸化并加dA尾：取5μL ChIP得到的dsDNA,加入2μL Template

Preparation buffer 及 1μL Template Preparation Enzyme.混匀后放入 PCR 仪中。22°C25 分钟，55°C20 分钟，4°C2 分钟。

3. 接头连接：在样本中加入1μL Library Synthesis Buffer及1μL Library Synthesis Enzyme.混匀后放入 PCR 仪中。22°C40 分钟，4°C2 分钟。

4. PCR 扩增：在样本中加入 25μL Library Amplification Buffer、1μL Library Amplification Enzyme 及 4μL Nuclease-free Water.混匀后放入 PCR 仪器中。

5. PCR 扩增产物纯化

a. 前取出 AMPure XP beads 放置于室温，涡旋震荡混匀。

b. 在样本中加入 50μL （1X） AMPure XP beads,使用移液器混匀。

c. 室温孵育 5 分钟。

d. 将混合样本短暂离心（不超过 500 rpm）并置于磁力架中。待溶液澄清后（约 8 分钟），小心移除上清。

e. 保持离心管始终处于磁力架中，加入 300μL 新鲜配制的 80%乙醇。室温孵育 30 秒，小心移除上清。重复此步骤两次。

f. 将离心管放于 37°C 金属浴中，开盖干燥磁珠 2 分钟。

g.加入 25μL Nuclease-free Water 进行 DNA 洗脱。涡旋振荡使充分混匀。将反应管短暂离心并置于磁力架中。待溶液澄清后（大约 8 分钟），小心吸取 22μL 上清至灭菌 PCR 管中。即得 DNA 文库。